Bộ tổng hợp CDNA sợi đầu tiên Thuốc thử PCR phiên mã ngược R1011/R1012

Bộ RT - PCR

Chỉ dùng cho nghiên cứu

Số mèo R1011, 20 rxns

Số mèo R1012, 100 rxns

Các thành phần của bộ

Kho

Tất cả các thành phần của bộ phải được bảo quản ở -20°C.Giữ RNA đối chứng ở -70°C để bảo quản lâu hơn.

Đ.mô tả

RT-PCR Kit được tối ưu hóa để tổng hợp cDNA chuỗi đầu tiên từ poly(A)+ tinh khiết hoặc RNA tổng số.RT-PCR Kit cho RT-PCR mang lại sản lượng cDNA tăng lên, độ nhạy cao và bản sao đầy đủ ở định dạng thuận tiện.Bạn nhận được tất cả các thành phần cần thiết để tổng hợp cDNA chuỗi đầu tiên thành công, tiết kiệm thời gian và đảm bảo thành công của bạn với mọi thử nghiệm.Bộ công cụ Reverse Transcriptase là một phiên bản của M-MLV RT đã được thiết kế để giảm hoạt động của RNase H và tăng độ ổn định nhiệt.Enzyme này được sử dụng để tổng hợp cDNA ở khoảng nhiệt độ 42-55°C, mang lại tính đặc hiệu cao hơn, sản lượng cDNA cao hơn và sản phẩm có độ dài đầy đủ hơn so với các enzyme phiên mã ngược khác.

Các ứng dụng

Tổng hợp chuỗi cDNA đầu tiên cho RT-PCR

Xây dựng thư viện cDNA

RT-PCR một bước

mở rộng mồi

TÔIghi chú quan trọng

Tránh ô nhiễm ribonuclease

Độ tinh khiết và toàn vẹn của RNA là điều cần thiết để tổng hợp cDNA có chiều dài đầy đủ.RNA có thể bị phân hủy bởi RNase A, đây là chất gây ô nhiễm có tính ổn định cao được tìm thấy trong bất kỳ môi trường phòng thí nghiệm nào.Tất cả các thành phần của bộ công cụ đã được kiểm tra nghiêm ngặt để đảm bảo rằng chúng không chứa RNase.Để tránh nhiễm bẩn cả môi trường phòng thí nghiệm và thuốc thử, tất cả các dung dịch đã chuẩn bị phải không chứa RNase.Các khuyến nghị chung để tránh ô nhiễm RNase:

• DEPC-xử lý tất cả các ống và đầu pipet được sử dụng trong quá trình tổng hợp cDNA hoặc sử dụng thiết bị phòng thí nghiệm không có nuclease được chứng nhận.
• Đeo găng tay khi xử lý RNA và tất cả các thuốc thử, vì da là nguồn phổ biến của RNase.Thay găng tay thường xuyên.
• Sử dụng thuốc thử không chứa RNase, bao gồm cả nước chất lượng cao (ví dụ: Nước được xử lý bằng DEPC).
• Sử dụng chất ức chế RNase, chẳng hạn như Dongsheng RNasin (#R2011) để bảo vệ RNA khỏi hoạt động của RNase.
• Giữ kín tất cả các bộ phận của bộ sản phẩm khi không sử dụng.Đậy kín tất cả các ống trong quá trình phản ứng sao chép ngược.

ARN mẫu

Tổng RNA di động được phân lập bằng các phương pháp tiêu chuẩn phù hợp để sử dụng với bộ kit.RNA tinh khiết phải không có muối, ion kim loại, ethanol và phenol để tránh ức chế phản ứng tổng hợp cDNA.Các chất gây ô nhiễm dạng vết có thể được loại bỏ bằng cách kết tủa RNA trong etanol, sau đó là hai lần rửa viên bằng etanol 75% lạnh.Đối với các ứng dụng RT-PCR, RNA mẫu phải không bị nhiễm DNA.Trước khi tổng hợp cDNA, RNA có thể được xử lý bằng DNase I để loại bỏ một lượng nhỏ DNA.DNase tôi phải được lấy bởi người dùng.Luôn thực hiện phản ứng đối chứng (RT-trừ) bao gồm tất cả các thành phần của RT-PCR ngoại trừ enzyme phiên mã ngược.

RNase H tiêu hóa

Độ nhạy của bước PCR có thể tăng lên (đặc biệt đối với các mẫu dài) bằng cách loại bỏ mẫu RNA khỏi phân tử lai cDNA:RNA bằng cách tiêu hóa với RNase H sau khi tổng hợp chuỗi đầu tiên.Sự hiện diện của RNase H trong quá trình tổng hợp chuỗi đầu tiên sẽ làm suy giảm mRNA mẫu, dẫn đến giảm tổng hợp cDNA chiều dài đầy đủ và giảm sản lượng của cDNA chuỗi đầu tiên.

sơn lót

Quá trình tổng hợp cDNA sợi đầu tiên có thể được mồi bằng mồi oligo(dT)15, mồi ngẫu nhiên hoặc mồi đặc hiệu cho gen.

Oligo(dT)15 tổng hợp cDNA nguyên tố từ đuôi poly(A) có ở đầu 3' của mARN sinh vật nhân chuẩn.Các mồi ngẫu nhiên bắt đầu quá trình tổng hợp cDNA từ quần thể RNA tổng số (rRNA và mRNA).Do đó, việc sử dụng đoạn mồi ngẫu nhiên để tổng hợp chuỗi đầu tiên dẫn đến độ phức tạp của cDNA được tạo ra cao hơn so với đoạn mồi oligo(dT)15.Do đó, độ nhạy và độ đặc hiệu của các phản ứng PCR tiếp theo có thể bị giảm.Tuy nhiên, có một số ứng dụng có lợi khi sử dụng đoạn mồi ngẫu nhiên, chẳng hạn như tổng hợp cDNA bằng cách sử dụng mARN không có đuôi poly(A) hoặc tổng hợp cDNA bằng cách sử dụng các mẫu RNA được làm giàu poly(A).

Đoạn mồi dành riêng cho gen được sử dụng để tổng hợp cDNA cụ thể từ một nhóm RNA hoặc mRNA tổng số và người dùng phải lấy.

Đầu tiên- squá trình tổng hợp trand cDNA

Phản ứng cDNA chuỗi đầu tiên có thể được thực hiện dưới dạng một phản ứng riêng lẻ hoặc dưới dạng một loạt các phản ứng song song với các mẫu RNA khác nhau.Do đó, hỗn hợp phản ứng có thể được chuẩn bị bằng cách kết hợp các thuốc thử riêng lẻ hoặc hỗn hợp chính chứa tất cả các thành phần ngoại trừ RNA mẫu có thể được chuẩn bị.Tùy thuộc vào cấu trúc của mẫu RNA, các bước biến tính RNA và ủ mồi riêng biệt có thể cải thiện kết quả RT-PCR.

Protocol

TÔI.Tổng hợp cDNA chuỗi đầu tiên

1. Thêm các thuốc thử sau vào ống vô trùng, không có nuclease trên đá theo thứ tự được chỉ định:

2. Trộn nhẹ nhàng, ly tâm nhanh và ủ ở 70°C trong 5 phút.Làm lạnh trên đá, xoay tròn và đặt lọ trở lại trên đá.

3. Chuẩn bị Hỗn hợp tổng hợp cDNA sau đây, thêm các thành phần sau theo thứ tự được chỉ định:

4. Trộn nhẹ và ly tâm nhanh.

5. Đối với ít (dT)₁₅, ủ trong 60 phút ở 42°C.Để tổng hợp mồi ngẫu nhiên hexamer, ủ trong 60 phút ở 37°C.

6. Kết thúc phản ứng bằng cách đun nóng ở 70°C trong 5 phút.

Sản phẩm của phản ứng phiên mã ngược có thể được sử dụng ngay trong các phản ứng tổng hợp cDNA sợi thứ hai hoặc bảo quản ở -20°C trong thời gian dưới một tuần.Để lưu trữ lâu hơn, nên sử dụng -70°C.

II.Khuếch đại PCR của chuỗi cDNA đầu tiên

Sản phẩm của quá trình tổng hợp cDNA sợi đầu tiên có thể được sử dụng trực tiếp trong PCR hoặc qPCR.Thể tích của hỗn hợp phản ứng tổng hợp chuỗi cDNA sợi đầu tiên không được chiếm quá 1/10 tổng thể tích phản ứng PCR.Thông thường, 2 μl hỗn hợp phản ứng tổng hợp cDNA sợi đầu tiên được sử dụng làm khuôn mẫu cho PCR tiếp theo với tổng thể tích 50 μl.