Mô tả sản phẩm

Bộ công cụ chuẩn bị thư viện DNA nhanhcho MGI

[Tên sản phẩm]

Bộ công cụ chuẩn bị thư viện DNA nhanh cho MGI

[Con mèo.Số/Spec.]

KM001-A/24 rxns;KM001-B/96 rxns;bao mẫu/ 6 rxns

[Mô tả Sản phẩm]

Hướng đến nền tảng giải trình tự thông lượng cao MGI, bộ công cụ này cung cấp sơ đồ xây dựng thư viện DNA tiện lợi và phổ biến trong một ống.Nó kết hợp sửa chữa đầu cuối và A-Tailing thành một bước và thuốc thử được trộn sẵn ở mức độ cao, giúp rút ngắn đáng kể thời gian xây dựng thư viện và giảm lỗi do các bước tẻ nhạt gây ra.Quá trình chuẩn bị cuối cùng, thắt bộ chuyển đổi, khuếch đại và tinh chế DNA sợi kép bị phân mảnh có thể được thực hiện trong khoảng 2 giờ.Định lượng toàn bộ thư viện có thể được thực hiện bằng phương pháp nhuộm huỳnh quang DSDNA (ví dụ: Thermo Qubit Flex Fluorometer) hoặc PCR định lượng tuyệt đối sau khi pha loãng thư viện đến nồng độ thích hợp.

[Loại mẫu]

[Điều kiện bảo quản & Thời hạn sử dụng]

Tất cả thuốc thử nên được bảo quản ở -20°C.Ligation Buffer là hiện tượng bình thường đối với các tinh thể kết tủa ở nhiệt độ thấp, nên cân bằng nó với nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.Sản phẩm có giá trị trong 12 tháng.

[Các thành phần]

* Nếu có nhiều hơn một mẫu, nên sử dụng hỗn hợp sơn lót bộ tiếp hợp #KM002 và #KM003.Bộ này cung cấp một bộ sơn lót.

Lưu ý: hạt lựa chọn được đề xuất: #NC1011 GDSPure DNA Selection Magbeads hoặc hạt AMPure XP.

[Ghi chú]

1. Chúng tôi cung cấp hai loại bộ mồi Bộ điều hợp chung (#KM002 và #KM003, được mua riêng), nhưng khách hàng cũng có thể chọn từ các nhà sản xuất khác hoặc tổng hợp Bộ điều hợp của riêng họ cho nền tảng giải trình tự MGI.Quá nhiều Adapter sẽ dẫn đến hình thành Adapter dimer, và không đủ Adapter sẽ dẫn đến đầu ra của thư viện thấp.Vì vậy, nồng độ Adapter thích hợp sẽ quyết định nồng độ và chất lượng của thư viện.Nồng độ bộ điều hợp được khuyến nghị cho các lượng đầu vào DNA khác nhau được trình bày trong bảng sau:

Bảng 1 Nồng độ sử dụng khuyến nghị của Adaptor

* Được biểu thị bằng tỷ lệ thể tích của bộ chuyển đổi so với chất pha loãng

2. Enzym được sử dụng trong 2× HIFI Library PCR Master Mix là một DNA polymerase họ B, có hoạt tính exonuclease 5 '-3' và 3 '-5', nhưng thiếu hoạt tính exonuclease 5 '-3'.Nó có độ trung thực và tính đồng nhất cao, và khả năng tổng hợp bền vững mạnh mẽ.Kiểm soát chặt chẽ số chu kỳ khuếch đại đặc biệt quan trọng đối với đầu ra thư viện.Bảng sau đây cho thấy số chu kỳ khuếch đại được khuyến nghị tương ứng với các lượng DNA đầu vào khác nhau:

Bảng 2 Số chu kỳ khuếch đại được đề xuất tương ứng với các đầu vào mẫu khác nhau

Lưu ý: 1. Bảng trên là kết quả xét nghiệm sử dụng DNA chuẩn 150bp, chỉ mang tính chất tham khảo.

2. Nếu sử dụng các đầu nối không hoàn chỉnh, số chu kỳ tối thiểu (1-3) phải được khuếch đại để có được một thư viện hoàn chỉnh.

3. Nếu chất lượng của DNA đầu vào kém hoặc việc lựa chọn kích thước được thực hiện trong quá trình xây dựng thư viện, số chu kỳ khuếch đại nên được tăng lên một cách thích hợp.

[Quy trình xây dựng thư viện chuẩn]

kết thúc sửa chữa

Lưu ý: Nếu DNA bị phân mảnh vượt quá 45 μl trước bước này hoặc bộ đệm không tương thích với bộ đệm sửa chữa cuối, thì trước tiên nên thực hiện quá trình tinh chế hạt từ tính.

1. Chuẩn bị phản ứng sau trong ống PCR 200 μl:

2. Vortex nhẹ và quay nhanh xuống để trộn đều, ly tâm nhanh và thu toàn bộ chất lỏng xuống đáy ống.

3. Thực hiện phản ứng sau trong máy tuần hoàn nhiệt:

bộ chuyển đổi lbắt đầu

1. Tiến hành phản ứng thắt càng sớm càng tốt sau khi chuẩn bị xong.

2. Pha loãng dung dịch theo Bảng 1.

3. Lập hệ phản ứng sau:

4. Vortex nhẹ và quay nhanh xuống để trộn đều, ly tâm nhanh và thu toàn bộ chất lỏng xuống đáy ống.

5. Thực hiện phản ứng sau trong máy tuần hoàn nhiệt:

Khuyến khíchSgiải pháp choDọn dẹp PCR/Lựa chọn kích thước(khối lượng hạt từ tính cụ thể phải được điều chỉnh theo mẫu thực tếkích cỡ)

1. Chuẩn bị 100 μl sản phẩm thắt vào ống ly tâm thích hợp.

2. Thêm 100 μl hạt từ tính chọn lọc DNA đã hồi phục vào mẫu.Thổi nhẹ bằng pipet 10 lần (hoặc xoáy trong 30 giây).Ủ mẫu trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.

3. Đặt ống lên giá nam châm thích hợp để tách các hạt ra khỏi phần nổi phía trên.Khi dung dịch trong, cẩn thận loại bỏ và loại bỏ phần nổi phía trên bằng pipet (không loại bỏ hạt).

4. Thêm 200 μl etanol 80% mới chuẩn bị vào ống khi đang ở trong giá đỡ từ tính.Ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 giây, sau đó cẩn thận lấy ra và loại bỏ phần nổi phía trên (không làm xáo trộn các hạt).

5. Lặp lại Bước 4 một lần cho tổng cộng hai lần giặt.

Lưu ý: Đảm bảo loại bỏ tất cả chất lỏng nhìn thấy được sau lần giặt thứ hai.

6. Làm khô các hạt trong không khí cho đến khi bề mặt của các hạt từ tính không còn độ bóng rõ ràng trong khi ống nằm trên giá từ tính với nắp mở.

Lưu ý: Không làm khô hạt quá lâu, điều này có thể dẫn đến khả năng phục hồi DNA thấp hơn.Khi các hạt bắt đầu nứt, chúng quá khô.

7. Lấy ống ra khỏi giá đỡ từ tính.Thêm 22 μl dung dịch đệm rửa giải (10mM Tris-HCl, pH8,0-8,5) vào ống.Trộn đều bằng cách hút lên và xuống ít nhất 10 lần hoặc trên máy trộn xoáy trong 30 giây.Ủ trong 3-5 phút ở nhiệt độ phòng.

8. Đặt ống lên giá nam châm.Sau 5 phút (hoặc khi dung dịch trong suốt), chuyển 20 μl phần nổi phía trên sang một ống mới.Việc lựa chọn đã hoàn tất và DNA được chọn có thể được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo hoặc được bảo quản ở -20°C trong một thời gian dài.

Khuếch đại thư viện

1. Chuẩn bị phản ứng sau trong ống PCR 200 μl:

2. Vortex nhẹ và quay nhanh xuống để trộn đều, ly tâm nhanh và thu toàn bộ chất lỏng xuống đáy ống.

3. Thực hiện phản ứng sau trong máy tuần hoàn nhiệt:

Khuyến khíchSgiải pháp choDọn dẹp PCR/Lựa chọn kích thước(khối lượng hạt từ tính cụ thể phải được điều chỉnh theo mẫu thực tếkích cỡ)

1. Chuẩn bị 50 μl sản phẩm thắt vào ống ly tâm thích hợp.

2. Thêm 45 μl hạt từ tính chọn lọc DNA đã hồi phục vào mẫu.Thổi nhẹ bằng pipet 10 lần (hoặc xoáy trong 30 giây).Ủ mẫu trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.

3. Đặt ống lên giá nam châm thích hợp để tách các hạt ra khỏi phần nổi phía trên.Khi dung dịch trong, cẩn thận loại bỏ và loại bỏ phần nổi phía trên bằng pipet (không loại bỏ hạt).

4. Thêm 200 μl etanol 80% mới chuẩn bị vào ống khi đang ở trong giá đỡ từ tính.Ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 giây, sau đó cẩn thận lấy ra và loại bỏ phần nổi phía trên (không làm xáo trộn các hạt).

5. Lặp lại Bước 4 một lần cho tổng cộng hai lần giặt.

Lưu ý: Đảm bảo loại bỏ tất cả chất lỏng nhìn thấy được sau lần giặt thứ hai.

6. Làm khô các hạt trong không khí cho đến khi bề mặt của các hạt từ tính không còn độ bóng rõ ràng trong khi ống nằm trên giá từ tính với nắp mở.

Lưu ý: Không làm khô hạt quá lâu, điều này có thể dẫn đến khả năng phục hồi DNA thấp hơn.Khi các hạt bắt đầu nứt, chúng quá khô.

7. Lấy ống ra khỏi giá đỡ từ tính.Thêm 22 μl dung dịch đệm rửa giải (10mM Tris-HCl, pH8,0-8,5) vào ống.Trộn đều bằng cách hút lên và xuống ít nhất 10 lần hoặc trên máy trộn xoáy trong 30 giây.Ủ trong 3-5 phút ở nhiệt độ phòng.

8. Đặt ống lên giá nam châm.Sau 5 phút (hoặc khi dung dịch trong suốt), chuyển 20 μl phần nổi phía trên sang một ống mới.Quá trình chọn lọc hoàn tất và DNA được chọn có thể được bảo quản ở nhiệt độ 2-8°C trong 1-2 tuần hoặc bảo quản ở -20°C trong thời gian dài.

[Phụ lục] Lược đồ được đề xuất cho lựa chọn hai mặt

Nếu cần lựa chọn hai vòng, chúng tôi cung cấp sơ đồ sau để chọn khối lượng hạt từ tính phù hợp theo kích thước thư viện dự kiến.Việc lựa chọn kích thước có thể được thực hiện trước khi kết thúc sửa chữa hoặc sau khi khuếch đại.Hai hoặc nhiều lựa chọn hai vòng sẽ làm giảm đáng kể năng suất của thư viện.

Điền vào thể tích thư viện trong bảng bên dưới đến 100 μl.Chọn khối lượng hạt từ trong hai vòng theo kích thước thư viện dự kiến.Và thực hiện thao tác lựa chọn theo hướng dẫn sau.

Bảng 3 Lượng hạt từ tính được đề xuất cho lựa chọn hai vòng

1. Đổ đầy thể tích thư viện đến 100 μl trong ống PCR 200μl và được dán nhãn là A. Thêm một lượng Hạt từ tính nhất định theo Bảng 3 (Vòng 1) vào ống A. Thổi nhẹ bằng pipet trong 30 giây.Ủ mẫu trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.

2. Đặt ống A trên giá nam châm thích hợp để tách các hạt ra khỏi phần nổi phía trên.Khi dung dịch trong, cẩn thận hút phần nổi phía trên sang một ống mới và dán nhãn là B. Loại bỏ các hạt.

3. Thêm một lượng Hạt từ tính nhất định theo Bảng 3 (Vòng 2) vào ống B. Thổi nhẹ bằng pipet trong 30 giây.Ủ mẫu trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.Đặt ống B trên giá nam châm.Khi dung dịch trong, cẩn thận loại bỏ và loại bỏ phần nổi phía trên.

4. Thêm 200 μl etanol 80% mới chuẩn bị vào ống B khi đang ở trên giá đỡ từ tính.Ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 giây, sau đó cẩn thận lấy ra và loại bỏ phần nổi phía trên (không làm xáo trộn các hạt).

5. Lặp lại Bước 6 một lần cho tổng cộng hai lần giặt.

Lưu ý: Đảm bảo loại bỏ tất cả chất lỏng nhìn thấy được sau lần giặt thứ hai.

6. Làm khô các hạt trong không khí cho đến khi bề mặt của các hạt từ tính không còn độ bóng rõ ràng trong khi ống B nằm trên giá từ tính với nắp mở.

Lưu ý: Không làm khô hạt quá lâu, điều này có thể dẫn đến khả năng phục hồi DNA thấp hơn.Khi các hạt bắt đầu nứt, chúng quá khô.

7. Lấy ống B ra khỏi giá đỡ từ tính.Thêm 22 μl đệm rửa giải vào ống.Trộn đều bằng cách hút lên và xuống ít nhất 10 lần hoặc trên máy trộn xoáy trong 30 giây.Ủ trong 3-5 phút ở nhiệt độ phòng.

Lưu ý: Nếu việc chụp nhắm mục tiêu không được thực hiện, hãy thêm dung dịch đệm rửa giải (10mM Tris-HCl, ph 8,0-8,5) để rửa giải.Nếu không, nên sử dụng nước siêu tinh khiết đã khử trùng để rửa giải.

• Đặt ống B lên giá nam châm.Chuyển 20 μl dịch nổi sang một ống mới.

Chỉ sử dụng cho nghiên cứu

 

GDSBio Là một doanh nghiệp công nghệ cao tập trung vào nghiên cứu và phát triển, sản xuất và kinh doanh các sản phẩm khoa học đời sống chất lượng cao.Công ty có một dòng sản phẩm hoàn chỉnh, lấy công nghệ PCR làm cốt lõi, tập trung vào PCR tổng quát, PCR định lượng huỳnh quang, lưu trữ NGS, điện di axit nucleic và các công nghệ sinh học phân tử khác, đồng thời đã phát triển các thuốc thử nghiên cứu phân tử, nguyên liệu chẩn đoán in vitro phân tử, thuốc thử chiết xuất và phát hiện axit nucleic và các sản phẩm khác.